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BAYERISCHER FORSCHUNGSVERBUND PRIONEN

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MPI 1 Untersuchungen zu Mechanismen und Prävention der Bildung von PrPSc

Arbeitsfeld:

Therapie der Prionkrankheiten

Unser Forschungsvorhaben hatte zum Ziel, den molekularen Mechanismus der Konversion des Prion-Proteins (PrPC) in pathogene Konformere aufzuklären, die neurotoxischen Wirkungen missgefalteter PrP-Konformere zu analysieren sowie mögliche, therapeutische Strategien zu entwickeln. Das Projekt wurde durch einen kombinierten Einsatz von in-vitro-Methoden (Experimente mit rekombinanten Proteinen) und in-vivo-Methoden (Untersuchung von neuronalen Zellen und infizierten Mäusen) realisiert. Durch den breiten Einsatz biochemischer, biophysikalischer und zellbiologischer Methoden wurden folgende spezifische Fragestellungen adressiert: Ziel 1:Identifizierung von Domänen, die bei der Missfaltung von PrP und der Propagierung von PrPSc eine Rolle spielen Im Rahmen dieses Forschungsvorhabens wurden verschiedene Strategien eingesetzt, um Einblick zu gewinnen in die Mechanismen der konformationellen Umwandlung von PrPC in pathogene Konformere. Zunächst generierten wir verschiedene PrP-Mutanten, um Domänen zu identifizieren, die bei der Maturierung und Missfaltung von PrPC eine Rolle spielen. Weiterhin analysierten wir verschiedene pathogene PrP-Mutanten, die beim Menschen mit vererbbaren Prion-Erkrankungen assoziiert sind. Schliesslich führten wir eine detaillierte Analyse zum Wirkungsmechanismus von Suramin durch, einer Anti-Prion-Substanz, die wir kürzlich in enger Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Schätzl identifiziert haben. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: - Helix 1 spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der Maturierung als auch bei der Aggregation von PrP. Die Generierung von komplex glykosyliertem PrP ist abhängig von einer Membranverankerung (Winklhofer et al., 2003, J Biol Chem). - Die C-terminale Domäne des Prion-Proteins ist notwendig und hinreichend für den Import in das Endoplasmatische Retikulum (Heske et al., 2004, J Biol Chem). - Pathogene Mutationen innerhalb der hydrophoben Domäne des Prion-Proteins interferieren mit der Faltung und Membranverankerung (Kiachopoulos et al., 2005, J Biol Chem). - An der Plasmamembran existiert ein Qualitätskontrollsystem für missgefaltete PrPKonformere (Kiachopoulos et al., 2004, Traffic). - Der polarisierte Transport von PrPC wird beeinträchtigt durch pathogene Mutationen innerhalb der hydrophoben Domäne sowie durch Doppel (Dpl), ein neurotoxisches Paralog von PrPC (Uelhoff et al., 2005, J Biol Chem). Ziel 2: Aufklärung der Bedeutung posttranslationaler Modifikationen bei derGenerierung von PrPSc Matures PrPC weist zwei komplex modifizierte Glykane sowie einen Glykosylphophatidylinositol (GPI)-Anker auf. Es stellt sich die Frage, ob diese posttranslationalen Modifikationen die Bildung und Propagierung von PrPSc beeinflussen. Mit Hilfe unserer Scrapie-infizierten murinen Neuroblastom-Zelllinie konnten wir zeigen, dass die Modifizierung von PrPC mit komplexen Glykanen für den Transport von PrPC zur Zelloberfläche nicht erfoderlich ist. Allerdings sind nicht-mature, mannose-reiche PrP-Glykoformen präferentielle Substrate für die Konversion von PrPC in PrPSc (Winklhofer et al., 2003, Traffic). In Kollaboration mit Prof. Oesterhelt und Prof. Engelhard entwickelten wir eine Strategie zur Herstellung von rekombinanten PrP mit Lipidanker und Fluoreszenzmarker (rPrPPalm), um die Konversion von PrP in missgefaltete Konformere im Scrapie-infizierten Zellkultursystem untersuchen zu können. In-vitro- und in-vivo-Analysen zeigten eine Inkorporation von rPrPPalm in Lipidvesikel bzw. in die Plasmamembran von neuronalen Zellen (Olschewski et al., 2007, submitted). Ziel 3: Analyze des neurotoxischen Effekts des PrP-Akkumulation im Zytosol Ein transgenes Maus-Modell zeigte, dass PrP im Zytosol ein neurotoxisches Potential hat. Wir konnten nun demonstrieren, dass zwei pathogene PrP-Mutanten, Q160Stop und W145Stop, die beim Menschen mit erblichen Prion-Erkrankungen assoziiert sind, teilweise im Zytosol lokalisiert sind und apoptotischen Zelltod induzieren können (Heske et al., 2004, J Biol Chem; Rambold et al., 2006, Mol Cell Biol). Wir haben daraufhin ein Hefe- und Zellkultur- Modell etabliert, um den Mechanismus der zytotoxischen Wirkung von zytosolischem PrP untersuchen zu können. Aus diesen Untersuchungen ging hervor, dass die Assoziation des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 mit missgefaltetem PrP im Kausalzusammenhang steht mit der toxischen Wirkung von zytosolischem PrP. Weiterhin konnten wir Evidenz erbringen für die protektive Wirkung molekularer Chaperone, die eine Sequestrierung von Bcl-2 verhindern können (Heller et al., 2003, J Biol Chem; Rambold et al., 2006, Mol Cell Biol). Ziel 4: Entwicklung von Strategien zur Inhibierung der Propagierung infektiöser Prionen Wir nutzen Scrapie-infizierte N2a-Zellen als Modell zur Identifizierung und Evaluierung von Substanzen mit Anti-Prion-Wirkung. In enger Zusammenarbeit mit Prof. Kretzschmar und Prof. Tavan haben wir mit Hilfe unseres Zellkultur-Modells eine Reihe von Substanzen getestet, die in einem vorangeschalteten in-vitro-Assay die Aggregation von PrP verhinderten. Im Rahmen dieses Projekts konnten neue Substanzen mit Anti-Prion-Aktivität identifiziert und patentiert werden (Bertsch et al., 2005, J Virol)( PCT/EP2005/005614).

Informationen

Gründungsdatum

07.2001

Ende

06.2007

Gefördert durch

Bayerisches Staatsministerium für Wissenschaft und Kunst

Gefördert durch

Bayerisches Staatsministerium für Umwelt und Verbraucherschutz